乙酰膽堿受體抗體檢測界值的優化及對重癥肌無力診斷效能的驗證

Optimization of the cut-offs in acetylcholine receptor antibodies and diagnostic performance in myasthenia gravis patients

李海峰，首都醫科大學宣武醫院神經內科；

邵凱，山東大學齊魯醫院（青島）醫學實驗中心；

郝洪軍，北京大學第一醫院神經免疫實驗室

乙酰膽堿受體抗體（AChRAb）是重癥肌無力（MG）的主要致病性抗體，在MG的診斷、亞組分類和療效監測中具有重要意義。

結合型AChRAb是最常檢測的抗體，目前常用方法有定量的酶聯免疫（ELISA）法和放射免疫沉淀（RIA）法以及半定量的細胞免疫熒光（CBA）法。無論商品化試劑盒還是實驗室自主開發的in-house試劑盒，驗證其臨床診斷效能既是檢驗醫生的課題，更是臨床醫生的課題。

在試劑盒開發過程中，往往采用從患者和對照取得的樣本，明確其敏感性、特異性等檢驗準確性的內在指標。定量檢測界值的設定對結果判斷分析的影響不應忽視，應該充分考慮診斷的實際需要以及漏診和誤診帶來的問題。

抗體陰性情況下，亦可通過新斯的明試驗和電生理診斷MG，但對不典型患者若僅有抗體陽性作為支持證據，則有可能誤診為MG而施以長期免疫治療，因此設定界值時需考慮在盡可能不減少敏感性的同時特異性適度優先。MG合并其他自身免疫疾病較常見，自身免疫疾病導致的非特異性結合有可能使抗體測量值略有升高，與MG鑒別診斷的疾病中也常有自身免疫疾病。對照組的設置會影響界值的設定，納入適合的正常對照人群和其他自身免疫疾病對照人群至關重要。

通常I期診斷試驗僅有患者樣本而無患者的具體信息，而MG是異質性很強的疾病，其診斷效能需要在具有不同臨床特征的患者中驗證。II期診斷試驗納入疾病臨床譜系中不同特征者，有助于驗證真實世界的診斷效能；同時因納入健康人對照和疾病對照，在界值優化過程中也充分考慮到鑒別診斷的疾病。因此，II期診斷試驗有助于同時解決上述兩個問題，建立合理的檢測界值并模擬真實世界人群驗證其診斷效能。

檢測結果有多種表達方法：ELISA法可表達為原始值（OD值）和轉化值（抑制率、根據標準曲線轉化而來的濃度[曲線濃度]、根據經驗公式轉化而來的濃度[經驗濃度]），RIA法表達為原始值（cpm值）和轉化值（結合率、經驗濃度）。

檢測界值設定可使用定性方法，其建立方法包括：

1、P/N比，為（待測樣本OD值-空白對照OD值）/（陰性樣本OD值-空白對照OD值），一般以P/N ≥ 2.1為陽性；

2、S/CO比，S是待測樣本OD值，CO為界值（cut-off），通常取值陰性對照平均值的2.1倍，間接法S/CO比 ≥1為陽性，競爭法S/CO比 ≤1為陽性。

目前更多使用定量方法設定界值，包括：

1、主觀法，包括1）符合正態分布的數據集直接使用mean ± 3SD，2）不符合正態分布的數據集使用百分位數法或轉換法（轉換成正態分布后計算mean ± 3SD再轉換回去形成界值），3）無論是否為正態分布均使用健康對照（HC）和其他自身免疫疾病對照（OAD）的最高值（粗暴法）；

2、ROC法，通過最大Youden指數獲得。

研究設計和結果

1. 患者和對照組的納入標準和排除標準

從同期500例MG患者中通過匹配性別、年齡、病程、采集樣本時受累（眼肌型、全身型、緩解）、最嚴重時受累（眼肌型、全身型）、伴胸腺瘤者占比以及采集樣本時和最嚴重時的QMGs評分等關鍵臨床特征，選取77例與真實世界人群臨床特征分布相近的代表性MG患者構成研究隊列。

MG符合下列診斷標準：疲勞試驗陽性、新斯的明試驗陽性和RNS低頻遞減，診斷由兩名MG專家共識取得。

患者的臨床特征見表1，具有與真實世界隊列相似的代表性分布。

表1 納入MG患者的臨床特征

80例健康查體者作為HC，中位年齡37歲，IQR為19歲（20-68歲）。

80例其他自身免疫性疾病（OAD）患者，中位年齡47.5歲，IQR為19.75歲（25-81歲），包括視神經脊髓炎譜系疾病（n = 18）、多發性硬化（n = 11）、Guilian-Barre綜合征（n = 8）、 CIDP（n = 4）、橋本甲狀腺炎（n = 9）、Graves病（n = 1）、類風濕性關節炎（n = 13）、系統性紅斑狼瘡（n = 10）、銀屑病關節炎（n = 2）、系統性硬化癥（n = 1）、系統性血管炎（n = 1）、強直性脊柱炎（n = 1）和過敏性紫癜性腎炎（n = 1）。

以上包括神經免疫疾病和系統性自身免疫疾病。MG患者和對照均排除合并慢性感染性疾病者。

2. 檢測方法和結果數據

使用商品化競爭性抑制ELISA試劑盒（RSR Ltd, Cardiff, UK）。在AChRAb存在下，MAb1-AChR-MAb2-/MAb3復合物的形成受到抑制，使OD值下降；血清中AChRAb濃度越高，OD值越低。抑制率計算為：100 ×（1-檢測樣本OD/陰性對照OD），經驗濃度計算公式為：0.2 × 2^{(0.067×抑制率)}。使用商品化RIA試劑盒（RSR Ltd, Cardiff, UK）。沉淀物的放射性與AChRAb結合的放射標記AChR的量成正比。AChRAb濃度計算公式為：（檢測樣本cpm-陰性對照cpm）× A/（C × K × B × 2.22），其中A為碘125自生產日期到檢測日期時的衰減因數，B為計數器效率，C為檢測中使用血清量（μL），K為用于標記AChR時碘125標記毒素的活度（Ci/mmol）；A、C、K值將隨各個批次試劑盒提供。采用Levey-Jennings質控圖對每批次檢測的原始值進行質控，陽性對照在mean±2SD范圍內認為批次檢驗合格。所有檢測盲法完成。

根據AChR抗體商品化ELISA和RIA試劑盒說明書提供的界值，其中一種方法判定陰性即作為AChR抗體陰性患者，使用商品化RIA試劑盒（RSR Ltd, Cardiff, UK）檢測MuSK抗體，共在22例患者中檢出1例MuSK抗體陽性者。

結果：所有樣本均在各自檢測方法的檢測范圍內獲得檢測值。提示試劑盒的檢測范圍可涵蓋絕大多數患者和陰性對照。每批次檢測陽性質控品用Levey-Jennings質控圖評估后均符合質控要求。

3. 界值的優化

3.1 去離群值

OD或cpm值超過mean±3SD者判定為離群值，在HC組和OAD組各發現1例離群值：HC組（OD=1.579, cpm=623.0）抗體水平較低，考慮為偶然誤差；OAD組（OD=0.985, cpm=4969.5）抗體水平較高，溯源發現為NMOSD患者，NMOSD與MG可能并發，但此例患者無MG臨床表現。最終79例HC和79例OAD納入分析。

3.2 批內和批間差異

結果：采用陽性質控品高、中、低三個濃度進行批內和批間質控，所有原始值和轉化值的變異系數（CV）均< 12%，顯示試劑盒檢測的可重復性。

3.3 確定界值

3.3.1 正態性檢驗和界值建立：

采用Shapiro-Wilk檢驗判斷原始值或轉化值是否符合正態分布。正態分布的數據集采用mean+3SD或mean-3SD計算界值；非正態分布數據集采用：1）97.5%分位或2.5%分位；2）轉換成正態分布數據后用轉換數據計算mean± 3SD再轉回作為界值。采用HC數據以及HC+OAD數據建立兩套界值。用HC+OAD數據集的最小值（OD值）或cpm值及所有轉化值的最大值形成一套界值（粗暴法）。從MG整組和HC+OAD組的OD或cpm值采用ROC獲得Youden指數最大時的界值。

結果：

用以上方法建立的界值見表2。以HC+OAD為對照組，采用粗暴法建立的界值與用mean±3SD統計法建立的界值接近，尤其是用原始值建立的界值。

表2 轉換方法、粗暴法和ROC法形成的界值

3.3.2 選擇界值：

以對照組的假陽性率低且MG組的陽性率下降不多為標準選擇界值。

結果：

以HC或HC+OAD作為對照，各界值的假陽性率和在MG組的真陽性率見表3。97.5%分位或2.5%分位法由于人為設定了假陽性率，獲得的界值最不理想，首先排除。以mean±3SD方法建立的界值中，以HC為對照形成界值的假陽性率顯著高于以HC+OAD為對照形成的界值。進一步散點圖（圖A、C分別為OD或cpm原始值，B、D分別為轉化值）分析可見OAD個體檢測到的抗體水平總體稍高于HC個體，提示自身免疫疾病的非特異性結合，證實選擇HC+OAD作為對照建立界值的合理性。采用HC+OAD為對照，采用統計法mean±3SD從原始值和轉化值建立的界值在對照的假陽性率為0~1.27%，在MG患者的真陽性率為74.03~77.92%。

表3 根據各界值得到的在對照個體的假陽性率和在MG患者的真陽性率

圖A~D OD值、cpm值和濃度值的離散性

3.3.3 選擇抗體水平的表達值

根據散點圖可見，HC和OAD的濃度值的離散程度均高于原始值（OD和cpm），因此將HC的原始值和轉化值的CV進行比較選擇最佳抗體水平表達值。

經過轉化后的數據，如果其變異較大，則有可能通過轉化工作曲線或公式放大其變異性。HC人群是理論上抗體水平變異最小的人群，因此進一步在HC個體原始值的10~90%范圍內等間隔選取數值計算轉化值進行模擬。

結果：原始值（OD或cpm）的CV最小（表4），模擬的結果也是原始值的CV最小（表5）。因此選擇原始值作為抗體定量檢測的表達值，并采用其相應界值完成后續分析。

表4 HC個體的原始值和轉化值的CV

表5 模擬計算得到的CV

采用原始值分析，用粗暴法建立的界值與用mean±3SD法建立的界值得到幾乎一樣的陽性率，進一步證實了原試劑盒采用粗暴法建立界值的合理性。但ROC法結果建立的界值雖然MG的真陽性率稍高，但對照組中的假陽性率明顯增高，因此無法作為界值（表3）。

表6 在MG整組及各亞組的診斷效能（最上一行[Ref]是整組使用試劑盒界值的結果，其他均為本研究建立的界值的結果）

5. 比較ELISA法和RIA法的檢測一致性

5.1使用散點圖判斷兩種方法抗體陽性者的一致性（圖E）

5.2 Spearmen秩相關判斷兩種方法抗體定量的一致性

結果：MG整組OD值和cpm值具有良好相關性（r_s=-0.92, 95%CI: -0.95~-0.88, p<0.01, n=77）（圖F），用兩種方法檢測均判為AChRAb陽性者也有良好相關性（r_s=-0.84, 95%CI: -0.91~-0.74, p<0.01, n=55）。

圖E 散點圖判斷AChRAb陽性者的一致性   圖F AChRAb定量值的相關性

5.3 定性判斷兩種方法的檢測一致性

分別用ROC曲線、Kappa檢驗和McNemar卡方檢驗判斷兩種方法的檢測一致性。

結果：ROC曲線顯示ELISA和RIA法檢測抗體陽性者間有良好的一致性（圖G，ELISA的AUC 95%CI: 0.89~0.97，RIA的AUC 95%CI: 0.90~0.98）。采用mean±3SD法建立的界值，陽性者在MG整組及其亞組均有中到高度的一致性，McNemar檢驗，p均>0.05；Kappa檢驗，加權к為 0.71~1.00，p均<0.01（表7）。采用ROC法建立的界值在MG整組的陽性者一致性較差，McNemar檢驗，p<0.01；加權к為0.66，p<0.01。

表7 各組患者用兩種方法判斷AChRAb陽性率的一致性及組間差異

圖G ROC法比較抗體陽性的一致性    圖H和I 雙圖ROC法進行抗體陽性者的一致性分析

5.4 兩種方法檢測不一致者的分析

觀察MG患者兩種方法檢測判斷抗體陽性的一致性，并用雙圖ROC法判斷不一致者是否落在灰區內。灰區指臨界值，取界值相應的敏感性和特異性兩側的10%為臨界（圖H和I）。

結果：55名MG患者ELISA和RIA法均為陽性，18名患者兩種方法均為陰性，4名（7.3%）患者在陽性判斷不一致。兩名患者ELISA法（OD 1.59和1.60，界值≤1.79）判為陽性而RIA法（cpm 1105.50和1179.00，界值≥1234.12）判為陰性。兩名患者ELISA法（OD 1.88和2.02）判為陰性而RIA法（cpm 2211.50和2769.00）判為陽性。落在灰區中者ELISA法10例，RIA法15例。兩種方法不一致者落在灰區中的ELISA法4例，RIA法3例。

兩種檢測方法陽性者的不一致主要來自檢測灰區（即臨界值范圍）。

6. 抗體水平與MG臨床特征間的關系

6.1 各臨床特征亞組兩種方法判斷AChRAb陽性者的差異

結果：以年齡、性別、胸腺瘤、采集樣本時的肌肉受累和嚴重程度（QMG_S評分）分組，結果見表7。采樣時全身型和嚴重者的陽性率顯著高于其對應亞組。

6.2 各臨床特征亞組AChRAb水平的差異

結果：各亞組的兩種方法的定量檢測值見圖J和L。年齡大、伴胸腺瘤、采樣時全身型及嚴重者的AChRAb水平高于其對應亞組。

圖J和圖L   ELISA法和RIA法定量檢測值在不同亞組間的差異

6.3 QMGs與抗體水平的相關性

結果：在兩種方法檢測均判為陽性者（n=55），ELISA法（r_s=-0.60，95%CI -0.75~-0.39， p<0.01）和RIA法（r_s=0.57，95%CI 0.36~0.73，p<0.01）檢測的抗體水平與QMGs中度相關。

圖K和M AChRAb陽性者ELISA法和RIA法檢測值與QMGs的相關性

優勢和不足

1. 優勢：

（1）以HC+OAD為對照，采用系統化的方法優化定量檢測的界值。

（2）采用主要臨床特征代表性的抽樣人群，并在MG整組及亞組驗證界值的診斷效力。

（3）詳細分析陽性者和檢測值與臨床特征的關系。

2、不足

（1）OAD對照不是MG的常見鑒別診斷疾病。但多數鑒別診斷疾病可通過病史、神經系統檢查和其他實驗室檢查來鑒別，而本研究設置OAD對照的目的是消除自身免疫背景所致的非特異性結合。

（2）HC和OAD組的樣本量較小。但給我們分析數據正態分布與界值關系提供了良好的機會，通過轉換成正態分布，我們建立的界值獲得了良好的診斷效力。

編輯：李尊波/謝琰臣；顧問：許賢豪。

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