谷氨酸脫羧酶(GAD)抗體是引起中樞神經系統某些自身免疫疾病的致病性抗體之一。對于該類抗體在不同人群和疾病組中的分布，多國學者均做過調查研究。目前其準確的發病機制仍待進一步闡明。
       今天筆者為大家帶來的譯文原文節選自西班牙巴塞羅那的奧古斯特·皮伊·蘇涅爾生物醫學研究所(IDIBAPS)發表的論文，希望能給廣大讀者帶來啟發。

文章信息

題目: 

GAD抗體相關神經系統綜合征抑制性突觸蛋白抗體的種類和分布

Antibodies to Inhibitory Synaptic Proteins in Neurological Syndromes Associated with Glutamic Acid Decarboxylase Autoimmunity

期刊：PLOS ONE

發表時間：2015年3月

作者：Nuria Gresa-Arribas, Helena Ariño, Eugenia Martínez-Hernández, Mar Petit-Pedrol, Lidia Sabater, Albert Saiz, Josep Dalmau, Francesc Graus

摘要

谷氨酸脫羧酶抗體與多種神經系統綜合征相關。目前仍不能明確綜合征的多樣性與不同的免疫顯性表位相關，還是與其他抑制性神經突觸蛋白的特異性抗體相關。我們對106位GAD抗體相關綜合征患者(39例小腦共濟失調、32例僵人綜合征、18例癲癇、17例邊緣葉腦炎)檢查了血清與腦脊液。GAD65抗體滴度使用ELISA定量檢測。免疫印跡法用于檢測GAD65與GAD67抗原表位是否為線性結構。在細胞學檢測中使用HEK293表達系統表達N端GAD65、中心催化功能域、以及C端GAD65，用于檢測免疫顯性域。GAD67、GABAA受體、甘氨酸受體、GABAa受體相關蛋白以及橋蛋白這些物質的特意抗體使用CBA檢測。GAD抗體內化使用培養的大鼠海馬神經元檢測。腦脊液GAD抗體滴度在小腦共濟失調患者與邊緣葉腦炎患者中要高于僵人綜合征患者(p=0.02）。在81%血清樣本與100%腦脊液樣本中檢出GAD67抗體。可被GAD65抗體識別的線性抗原出現于98%的患者中，相比之下GAD67抗體可識別的抗原僅占42%。GAD65催化結構域在93%的患者血清中被識別，22%的血清和74%的腦脊液能同時識別N端，C端以及磷酸吡哆醛(PLP, GAD輔酶)這三個結構域。六例GABAa受體抗體陽性患者和另外六例甘氨酸受體抗體陽性患者未出現相關癥狀。無患者檢出GABAa受體相關蛋白抗體和橋蛋白抗體。GAD65抗體在活的神經元細胞中未發現內化現象。總之，這些研究指出，無論神經系統綜合征如何，腦脊液對GAD的免疫應答要普遍于血清，也未發現臨床表現與抑制性突觸蛋白相關抗體間的特異性關聯。

簡介

高滴度的谷氨酸脫羧酶抗體可見于多種神經系統綜合征患者的血清中，包含僵人綜合征、小腦共濟失調、癲癇以及邊緣葉腦炎。這些病癥均表現為神經系統GABA能系統異常。目前尚不清楚部分患者發展為特定綜合征的病因。與GAD抗體關聯的神經系統綜合征初描述于1988年，但到目前為止，未再有更大更全面的研究來比較不同抗GAD相關綜合征患者的免疫反應譜和異質性。目前已有的研究規模較小或局限于僵人綜合征，重點在GAD65表型，或僅研究患者血清。此外根據推測，在GAD抗體陽性和LE或癲癇患者中，這些癥狀可能是由針對細胞表面抗原的更相關的自身抗體引起的，并且這些癥狀對免疫治療反應良好。從另一個角度，某些邊緣葉腦炎患者和單獨的GAD抗體陽性患者可能癥狀更重。因此，確定不同的GAD抗體相關綜合征患者是否具有不同的潛在免疫應答可能具有實際的臨床意義。

針對GAD65抗體的致病顯著性仍存爭議。部分研究指出這些抗體是直接的致病因素，但有些證據得出的結論與此相反。首先，相比于其他神經系統表面抗原引起的自身免疫神經系統疾病，GAD抗體陽性神經系統綜合征的免疫治療效果較差；其次，疾病嚴重程度與抗體滴度間未發現相關性；第三，目前尚無這種神經系統障礙的可信動物模型。闡明致病機制目前仍需重要一步：GAD抗體可與活的神經元結合，在內化后可結合到胞內GAD抗原。

為了驗證這些問題，我們檢測了106例不同的GAD抗體相關神經系統疾病患者的血清中如下幾種結構的抗體：主要免疫優勢區，線性抗原和構象抗原，抑制性突觸受體或其他蛋白的共存抗體。除此之外觀測了GAD抗體是否會被活神經元細胞內化。

研究方法

患者選自1994年12月至2013年4月間，均由作者或相關醫師診治。這些患者的血清或腦脊液在西班牙巴塞羅那奧古斯特·皮伊·蘇涅爾生物醫學研究所(IDIBAPS）的神經免疫學實驗室，或美國費城的賓夕法尼亞大學中完成檢測。入組標準為：存在神經系統障礙的患者經腦部免疫組化檢測血清GAD65抗體，并由HEK239構建的CBA加以確認。其中，免疫組化步驟用于檢測在放射免疫法下GAD抗體滴度大于2000u/ml的患者。低于這個濃度的患者均患有1型糖尿病，多數從未有過神經系統癥狀。明確或疑似副腫瘤綜合征的患者不包含在本研究中。

方法學構建基于大鼠小腦的免疫組化

藉由親和素-生物素技術，GAD抗體的免疫反應通過PFA固定的冷凍大鼠小腦觀察。待測血清稀釋500倍，腦脊液使用原濃度。在二抗的選擇中，使用四種鼠抗人IgG1-4作為不同的生物素標記二抗，用以研究這種抗體的IgG亞型。

為了研究GAD抗體的鞘內合成，使用免疫組化得到的GAD滴度結果，連同其對應的腦脊液濃度將配對，同時使用腦脊液/血清白蛋白比值來計算GAD抗體的鞘內合成指數。大于1的比值提示特異性IgG的鞘內合成。

GAD65 ELISA

GAD抗體水平使用RSR的ELISA檢測。使用方式均參考產品說明書。由于神經系統綜合征中GAD抗體濃度較高，血清和腦脊液中抗體的濃度在檢測前一般需要滴定來確認稀釋度。一般來講，血清稀釋10000倍或腦脊液稀釋200倍后開始檢測流程。

免疫印跡法

人類GAD65、GAD67、GABARAP重組蛋白通過電泳進行分離，隨后轉移至PVDF膜上同患者稀釋1000倍的血清孵育。先后結合GAD65、GAD67、GABARAP對應的商品抗體和生物素標記的羊抗人或馬抗鼠IgG后，使用DAB鹽酸鹽顯色。在部分試驗中我們使用ECL印跡系統。商品化GAD65和GAD67抗體的特異性通過CBA予以確認。

基于HEK293細胞的免疫細胞化學染色

為了檢測不同突觸抗原的對應抗體，HEK293細胞中轉染了人類GAD65和GAD67，以及GABAaR和GABARAP的α1和β3亞單位、甘氨酸受體α1亞單位、橋蛋白。轉染24小時后HEK293按流程開始活細胞或固定后檢測。HEK293和40倍稀釋的患者血清或5倍稀釋的腦脊液孵育，同時結合相應的商品化抗體，然后與羊抗人IgG Alexa Fluor 488或羊抗鼠IgG孵育。當使用活的HEK293時，使用4%PFA和0.3% triton X-100進行固定操作。完成同患者血清和商品化抗體結合的操作后，使用熒光顯微鏡照相。

為了驗證構建的CBA，使用50例不同神經系統障礙患者(20神經系統退行性變、15例NMDAR抗體陽性、10例Hu抗體陽性、5例其他神經免疫疾病)的血清和17例1型糖尿病患者血清進行性能驗證。全部血清在本CBA中均檢測為陰性。T1DM組患者中，10例患者抗體滴度較高。這提示本方法相比于放射免疫法，在T1DM典型的抗體滴度區間內對低滴度GAD65抗體缺乏足夠的靈敏度。

GAD65表型分析

我們設計了表達N端(aa 1-188）、中心區含磷酸吡哆醛(aa189-464)、C端(aa465-585）GAD65的質粒。轉染至HEK293后進行相應的免疫組化實驗。每種成分的成功表達使用Myc標簽蛋白的對應商品抗體加以確認。

神經元表面抗原抗體的分析

使用大鼠腦組織實施免疫組化和大鼠海馬、腦神經元培養細胞進行免疫熒光的方式加以研究。

GAD抗體內化研究

為研究GAD抗體的內化過程，GAD抗體陽性腦脊液稀釋25倍后，在37℃下和大鼠海馬神經元細胞孵育24小時。清洗后和未標記的抗人IgG抗體37度孵育1小時。清洗后使用4%PFA和0.1%triton X-100固定，再加入Alexa Fluor 488標記的抗人IgG。我們選擇了NMDAR抗體陽性的腦脊液作為陽性對照。

統計分析

使用非參數檢驗、卡方、ANOVA作為檢驗方法。由于ELISA值不遵從正態分布，在統計分析前使用對數變換將其標準化。P<0.05視為有顯著意義。

結果

抗體檢測結果

在CBA中，100%患者均檢出GAD65抗體、88%患者檢出GAD67抗體。GAD67抗體在小腦共濟失調、僵人綜合征、邊緣葉腦炎以及癲癇組中無頻數的顯著差異。相反，全部腦脊液(61例）均同時檢出GAD65和GAD67抗體。在配對樣品中有9對樣品呈現血清陰性但腦脊液GAD67陽性。這9例樣品均勻分布與各患者組中。免疫組化分析IgG亞型顯示全部106例患者中占主導地位的亞型為IgG1。

在小腦共濟失調組和邊緣葉腦炎組中，血清GAD65抗體水平較高。在腦脊液中這個結論也成立，即共濟失調組和邊緣葉腦炎組的腦脊液濃度高于僵人綜合征組。此外，小腦共濟失調組的鞘內合成指數的中位數(9.7)也要高于僵人綜合征組(5.3),p=0.38. 無論患者血清中是否含有GAD67抗體，血清GAD67抗體含量與GAD65濃度均相關(p=0.02)

GAD抗體表型分析

為闡明GAD65與GAD67抗體是否能辨識線性抗原，全部106例樣品使用免疫印跡法進行篩查。除兩例外其余98%樣品均和GAD65抗原反應。39例（39/93)GAD67陽性患者為免疫印跡陽性。可與GAD67反應的血清，與特定的神經系統綜合征間無相關性。

研究GAD65抗體與不同癥狀組GAD65抗原活性區(N/C/PLP）間的關系。由于亞克隆并未對GAD65免疫活性構成影響，我們使用全部106例血清和腦脊液使用轉染這三個部分的HEK239進行檢測。46%患者血清GAD65抗體僅識別一個區域，相比之下74%GAD65陽性腦脊液可識別全部三個區域。被識別頻數占據主流的部分為磷酸吡哆醛(PLP），有93%患者樣品可識別此結構域，這其中也包含部分GAD65抗體濃度較低的患者。GAD65抗體水平和對特定表型的反應間無相關性。邊緣葉腦炎患者組的GAD65抗體更傾向于結合N端域，癲癇組患者體內抗體傾向于結合C端域。我們在腦脊液結果中未發現此差異。抗體識別的結構域數量頻數在有或無GAD67的兩組抗體組中較相似。因此GAD67抗體的存在與GAD65反應程度無相關性。

GABA能抑制性突觸的其他抗體

106例血清和61例腦脊液接受了大鼠海馬神經元免疫熒光測試。其中6名患者檢出GABAaR抗體，6名患者檢出甘氨酸受體抗體陽性。除此之外未檢出其他抗體。

GAD抗體的內化過程

假定GAD抗體為致病抗體，抗體應能接觸到胞內抗原，因此該抗體可形成內化。在這個試驗中我們首先確認我們培養的神經元細胞內包含有GAD65。首先我們固定了神經元細胞，然后分別同商品化的GAD65抗體以及患者的腦脊液一同孵育。在這項預試驗中我們確認了細胞內含有對應抗原，同時商品抗體和患者腦脊液中均觀察到當細胞膜通透時，發生了抗原抗體結合。我們又實驗了患者體內的抗體能否同活的神經元細胞反應，使用大鼠海馬神經元細胞分別同4例小腦共濟失調、4例僵人綜合征、3例邊緣葉腦炎、5例癲癇患者的含抗體腦脊液孵育24小時。在這個實驗中我們選擇了一例抗NMDAR腦炎患者的腦脊液作為對照。實驗結果中我們未觀察到4個實驗組以及對照組出現胞內染色。因此我們得出結論，GAD65抗體僅僅在細胞膜高通透狀態下與GAD65抗原結合，在活體神經元細胞中無法完成這一過程。

討論和結論

我們總結了以下特性：

1. 在血清和腦脊液中的體液免疫響應存在差異。腦脊液中的抗體可以與多個結構域結合，同時與GAD67可發生反應。由于9/61例患者出現血清陰性腦脊液陽性的結果，加上腦脊液抗體可識別更別結構域，這提示腦脊液中的GAD65抗體不僅僅是從血清到腦脊液的被動轉移，還可能存在中樞神經系統的主動響應。

2. 邊緣葉腦炎和小腦共濟失調患者的腦脊液抗體滴度比僵人綜合征患者高。

3. 全部神經系統綜合征患者中GABA能抑制性突觸抗原抗體出現的頻數非常少

4. GAD抗體因其未觀察到內化效應，因此可能不是直接的致病因素。

5. 我們未發現橋蛋白和GABARAP抗體。過往報道中指出僅1例僵人綜合征患者伴發縱隔腫瘤時檢出這兩種抗體，但報道發表于2006年且從未被重現過。同時檢測方法學也存在差異：GABARAP抗體初使用免疫共沉淀和免疫印跡法檢測，我們在本研究中使用CBA。我們無法證實是否因CBA的靈敏度過低導致這種結果，如果并非如此，GABARAP抗體的水平應非常低。

6. GAD65抗體表型的研究中提示，1型糖尿病中的GAD65抗體大部分識別磷酸吡哆醛部分和C端結構域。先前的僵人綜合征隊列研究中指出，GAD65抗體識別C端兩個不連續的結構域，大部分血清抗體可識別N端至少一個結構域。其他研究者也發現了一個位于N端的線性表型抗原。在我們的研究中磷酸吡哆醛部分是血清抗體識別頻數多的，在全部僵人綜合征患者中均可被識別，可認為是提供主要免疫原性的部位。在全部4個患者組中我們未發現主要免疫原部位的顯著差異。由于本研究中將GAD65分解為3個大片段，可能會遺漏一些較小的蛋白質片段，這些片段抗原有可能會引起特定的神經系統綜合征。

7. GAD抗體的病理學作用一直受到爭論。體外研究指出僵人綜合征患者的GAD抗體抑制了GAD65的酶活性，而1型糖尿病患者的抗體不存在這個現象。來自GAD抗體陽性的僵人綜合征患者和小腦共濟失調患者純化的抗體或直接使用人單抗，經鞘內或小腦內注射后可誘發類似這些患者的癥狀或神經生理學改變。然而這些實驗未能明確闡述這些變化與GAD65抗體直接相關。于此相似的是對動物的主動免疫實驗并未引起神經系統障礙。想證明GAD65的直接致病性需要先證實GAD65抗體在活體內存在內化反應。先前研究中指出GAD65人單抗可被大鼠中樞神經系統細胞系內化，或被大鼠腦皮層注射部位附近的神經元內化。然而這些研究無一例證實體內也存在相同反應。為了進一步探究GAD65的致病性，我們需在將來的研究中明確的闡述動物模型中GAD抗體如何到達抗原處，通過高分共聚焦顯微鏡觀察抗原抗體的結合，觀察與綜合征相關聯的GAD的潛在影響。

因此，本研究重申了研究中樞神經系統綜合征患者腦脊液中GAD自身免疫的重要性，因其抗體在中樞神經系統中可識別抗原上多種免疫原結構域。我們未發現GAD抗體相關綜合征中特定的免疫優勢區或相關抗體可作為標志物。更多的是，GAD抗體因其在活細胞中無法內化，其直接致病性仍存疑。